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液相色谱柱的选择方法概述
发布时间:2019-12-10   点击次数:866次

液相色谱柱的选择方法概述

选择方法一:填料的种类

填料的基质一般选择使用多孔硅胶或聚合物等,在细孔的表面有多种经过化学修饰的官能团。

利用目标成分疏水性的不同起到分离效果的反相分离模式,利用极性不同进行分离的正相分离模式,根据分子大小的不同而分离的尺寸排阻模式,根据离子性质的不同而达到分离的离子交换模式,又或者分离光学异构体等,根据目的的不同,需要

选择对应的填料。

作为填充剂的代表十八烷基、辛基、丁基等即在硅胶的细孔表面化学键合的 C18(ODS)、C8 或 C4 等,碳链越长,疏水性(保留能力)越强。

 

选择方法二:填料孔径

多孔硅胶为基体的填料表面具有无数的细孔,需要根据目的成分的分子量选择对应大小的填料孔径。微孔径 100Å(10nm)对 应 5000 左右 的 分 子 量。 分 子 量 大 于 5000 的, 可 以 选 择300Å(30nm)或以上的大孔径柱子。目的成分能够进入孔的话,才能与官能团相互作用从而起到分离的效果。对于大分子蛋白质或聚合物等高分子,如果不是大孔径的基体,与官能团的相互作用就会减少。另外,分析低分子时,选择太大的微孔,由于会扩散故导致峰型可能会展宽。

 

选择方法三:填料粒径

一般 HPLC 多使用粒径为 5μm 的球状硅胶,近年来也逐步开始使用 2μm 以下的微粒子,粒径越小色谱柱理论塔板数就越高,得到峰型也就越尖锐,分离越好。而且,粒径越小,即使流速上升,理论塔板数降低很少,微粒子色谱柱越来越适合快速分析。但是,微粒子使用时,必须注意使用压力。3μm 以下适合UHPLC快速分析,3 ~ 5μm 适合一般的 HPLC 柱分析,10μm 则作为制备 HPLC 柱使用。

 

选择方法四:色谱柱尺寸 (长度)

一般使用较多的色谱柱的长度,通用型,制备 HPLC 柱长度为150 ~ 250mm,LC/MS 为 100-150mm,超快速 HPLC(UHPLC)为 50-100mm。色谱柱长度越长理论塔板数也越高。只是,需要注意,色谱柱长度加倍后,分析时间与使用压力也会加倍。

对于 2μm 或者 3μm 的微粒子,分离度和理论塔板数都较好时,将色谱柱的长度变短,可以缩短分析时间,进行快速分析。

 

选择方法五:色谱柱尺寸 (内径)

一般通用的 HPLC 柱内径为 4.6mm,LC/MS 内径多为 2.1mm,毛细管 HPLC 色谱柱为不满 1mm,制备 HPLC 色谱柱6.0mm 以上。通用 HPLC 系列,内径不同得到的结果也不同。即使改变内径,根据色谱柱的截面积比改变相应的流速,保留时间基本不会改变。特别是对于像 UV、RI 一样对于浓度要求很高的检测器而言,流速越小,其对应的灵敏度也越高。需要注意的是,通用型 HPLC 色谱柱内径太小,装置的死体积(管路内多余的配管或者流通池容量)影响变大,峰型会变宽。并且根据 HPLC 系统使用目的的不同(分析、制备、毛细管等)种类也不同,能够设定的正确的流速与流速范围,系统响应等也会不同,所以根据系统不同选择对应的内径是十分重要的。

 

选择方法六:端基封尾

端基封尾是硅胶表面有一种被称为硅醇基的弱酸性官能团(Si-OH)存在。作为反相分配填料等合成时,利用硅醇基对十八烷基(ODS:C18)进行化学键合。然而,部分没有键合残留的硅醇基会与碱性化合物吸附,引起峰拖尾。为了防止这种现象,使用甲基等短链基团对残存硅醇基进行处理,这个过程就称作端基封尾。选择 ODS 色谱柱时,请选择进行端基封尾的柱子。下述作为参考,反相色谱柱的一些相互作用。

 

相互作用的类型:

◆疏水性相互作用

疏水性高的物质之间会有相互牵引作用,与相似相溶道理一样,填料结合基团的碳链(烷基链)越长疏水性越高。

◆离子性相互作用

在反相分析中,弱酸性的硅醇基能与碱性化合物结合,与酸性化合物会发生排斥,会对峰型及保留时间有影响。更适合使用端基封尾处理的柱子或者调节溶剂的 PH 值,抑制这种作用。

◆氢键

氢原子易与电负性高的原子发生结合,如与氧、氮、硫、卤素以及芳香环的 π 电子等作用。

◆π 电子相互作用

像苯环这类具有 π 电子结构的化合物,相互之间会有电子吸引作用。像苯基柱这类具 π 电子作用的柱子,对于目标物的 π 电子具有选择性,通过此相互作用起到分离效果。

◆金属配位吸附

填充剂硅胶基质内会含有部分残留的金属,故易会引起配位化合物的吸附现象。而且,解离的硅醇基与金属离子一旦发生配位,会发生峰拖尾或者目的成分不能被洗脱的状况。

 

选择方法七:色谱柱接头形式

HPLC 色谱柱的接头根据厂家的不同也会有不同。一般分析色谱柱是 1/16 英寸外径的管子使用螺丝进行连接,若连接不同的接口,较易产生死体积与漏液现象。

特别对于不锈钢的配管等,需用套圈固定管子,就必须选择对应的接口形式。

接口形式和螺距有英寸螺距和毫米螺距两种。一般 Waters 接口型使用比较普遍。无论是 HPLC 或 UHPLC,通过选择适当的色谱柱接口形式,InertSustain 以及 Inertsil 的性能能够充分的发挥(标准接口为 Waters 接口型)。

 

选择方法八:经常使用的色谱柱规格

◆HPLC 分析

5μm, 150×4.6mm I.D.

5μm, 250×4.6mm I.D.

◆UHPLC, LC/MS 分析

2μm, 50×2.1mm I.D.

2μm, 100×2.1mm I.D.

3μm, 75×2.1mm I.D.

◆LC/MS 分析

3μm, 100×2.1mm I.D.

3μm, 150×2.1mm I.D.

5μm, 150×2.1mm I.D

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